หลักการพื้นฐานของเทคนิค Real- time PCR และการอ่านผลการทดสอบ
Real-Time PCR นางสาวสกุณา พัฒนกุลอนันต์
ห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ
ยุคที่เทคโนโลยีการวินิจฉัยโรคเป็นการตรวจหาสารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรคซึ่งปัจจุบันมีเทคนิคใหม่ๆเกิดขึ้นมากมาย แต่เทคนิคที่มีบทบาทสำคัญและยังเป็นที่นิยมใช้ในปัจจุบัน ได้แก่ Real-Time PCR หรือที่เรียกว่า quantitative PCR (qPCR) ซึ่งหากคุ้นเคยกับเทคนิค PCR อยู่แล้ว จะพบว่า Real-TimePCR เป็นการต่อยอดจาก PCR ซึ่งปัจจุบันมีหลายรูปแบบ โดยรูปแบบที่นิยมจะอาศัยหลักการเพิ่มปริมาณ DNA หรือ RNA ต้นแบบ ด้วยการใช้ไพรเมอร์ 1 คู่ ร่วมกับโพรบ (probe) ที่ได้รับการออกแบบให้มีความจำเพาะเจาะจงกับสารพันธุกรรมเป้าหมายที่ต้องการตรวจสอบ โดยโพรบจะถูกติดสารเรืองแสงในกลุ่ม Fluorescence ที่จะมีความเข้มสารเรืองแสงเพิ่มขึ้นเมื่อมีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเป้าหมาย โดยปริมาณสารเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจะมีสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของสารพันธุกรรม ที่ขยายเพิ่มขึ้นจากปฏิกิริยาในแต่ละรอบ ซึ่งทำให้ Real-Time PCR สามารถตรวจวัดและประเมินปริมาณของสารพันธุกรรมได้ในระหว่างที่ปฏิกิริยาดำเนินไปได้ทันทีโดยไม่จำเป็นต้องรอให้สิ้นสุดการทำปฏิกิริยา เทคนิคสามารถใช้ตัวอย่างในการทดสอบได้หลากหลายไม่ว่าจะเป็น เลือด ซีรั่ม น้ำลาย ชิ้นเนื้ออวัยวะ อุจจาระ หรือแม้กระทั่งสวอปทั้งจากตัวสัตว์หรือสิ่งแวดล้อม ปัจจุบันองค์การสุขภาพสัตว์โลก (WOAH) ได้มีการยอมรับให้ใช้ผลการทดสอบด้วยเทคนิค Real-TimePCR ในส่วนของการวินิจฉัยโรคที่สำคัญๆ ในสัตว์หลายชนิด เช่น โรคพิษสุนัขบ้า (Rabies) โรคไข้หวัดนก (Avian Influenza) โรคปากและเท้าเปื่อย (Foot and Mouth Disease) โรคพีอาร์อาร์เอส (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) โรคอหิวาต์แอฟริกาในสุกร ( African Swine Fever) และโรคกาฬโรคม้าแอฟริกา (African Horse Sickness, AHS) เป็นต้น
ที่มา https://clinicalsci.info/real-time-pcr
การอ่านค่าจากผลการทดสอบจากเทคนิค Real-Time PCR ที่ออกจากศูนย์ชันสูตรโรคสัตว์ กำแพงแสน กรณีที่ใช้เพื่อการทดสอบหาเชื้อก่อโรคโดยในใบรายงานผลการทดสอบจะระบุ Negative หรือ Not Detected ซึ่งหมายความถึงการตรวจที่ไม่พบสารพันธุกรรมของเชื้อก่อโรคที่สงสัย แต่ถ้าหากใบรายงานผลทดสอบระบุ Positive หรือ Detected จะมีค่า Ct หรือ Cq มาให้ด้วยเสมอ โดยถ้าหากแปลความหมายให้เข้าใจง่ายในการวิเคราะห์ปริมาณเชื้อคือ ยิ่งค่า Ct ต่ำแสดงว่ามีปริมาณของเชื้อจากสิ่งส่งตรวจมีปริมาณมาก แต่เมื่อค่า Ct สูง แสดงว่ามีปริมาณของเชื้อจากสิ่งส่งตรวจมีปริมาณน้อยเพราะค่า Ct หรือ Cq คือตัวเลขที่แสดงถึงจำนวนรอบของการเกิดปฏิกิริยา Real-Time PCR จนสามารถตรวจวัดปริมาณสารเรืองแสงที่เกิดจากการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม
ห้องปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ ศูนย์ชันสูตรโรคสัตว์ กำแพงแสน ให้บริการทดสอบหาเชื้อก่อโรคในสัตว์ที่สำคัญๆ ด้วยเทคนิค Real-Time PCR ด้วยชุดไพรเมอร์และโพรบที่มีได้รับการแนะนำจาก WOAH และชุดทดสอบโรคทางการค้าที่ได้รับการยอมรับในระดับโลก สำหรับใช้ในสุกร สัตว์น้ำ ม้า สัตว์ปีก ช้าง และนกสวยงาม และในทุกการทดสอบยังมีการควบคุมกระบวนการทดสอบในทุกขั้นตอนตั้งแต่การสกัดสารพันธุกรรมจนถึงการรายงานผลการทดสอบด้วย Internal control Negative control และ Positive control อีกทั้งศูนย์ชันสูตร ฯ ยังเข้าร่วมโปรแกรมทดสอบความชำนาญ (Proficiency testing) และการเปรียบเทียบผลการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ (Interlaboratory comparison)กับหน่วยงานทั้งในและต่างประเทศเพื่อยืนยันความสามารถของเจ้าหน้าที่ และวิธีการทดสอบ นอกจากนี้การทดสอบหาเชื้อโรคพีอาร์อาร์เอส (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ,PRRS) ในตัวอย่างซีรั่มสุกร ด้วยเทคนิค Multiplex Real Time RT-PCR และ การทดสอบหาเชื้อโรคอหิวาต์แอฟริกาในสุกร (African Swine Fever, ASF) ในตัวอย่างเลือดสุกร ด้วยเทคนิค Real Time PCR ของศูนย์ชันสูตรโรคสัตว์ กำแพงแสน ยังได้รับการรับรองมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2017 และนอกเหนือจากวิธีการทดสอบที่ให้บริการอยู่แล้วทางห้องปฏิบัติการฯยังรับบริการพัฒนาเทคนิค Real-time PCR เพื่อทดสอบหาเชื้อก่อโรคอื่นๆตามความต้องการของผู้ขอรับบริการ โดยสามารถติดต่อสอบถามรายละเอียดและค่าบริการได้ที่ หมายเลขโทรศัพท์ 081-9868118 Facebook : ศูนย์ชันสูตรโรคสัตว์ กำแพงแสน คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ และที่ Line : @ kvdc.kps
อ้างอิง
- OIE Guidelines for Veterinary Laboratories., International Reference Standards for Polymerase Chain Reaction assays., OIE.
- WOAH Terrestrial Manual 2021., Chapter 2.1.2., Biotechnology advances in the diagnosis of infectious diseases,. WOAH.
- https://www4.fisheries.go.th/local/file_document/20191225105459_1_file.pdf
เปิดให้บริการทุกวัน
จันทร์-อาทิตย์ เวลา 8.30-16.30 น.
ติดต่อสอบถามเพิ่มเติม
ติดต่อ 081-9868018
E-mail : kuvetdiag@ku.th
Line OA : @kvdc.ku
