การย้อมสีพิเศษด้วยวิธี IPMA (Immunoperoxidase Monolayer Assay)
ความเป็นมา
การวินิจฉัยโรคติดเชื้อไวรัสในห้องปฏิบัติการสามารถทำได้หลายวิธี หนึ่งในวิธีที่มีความแม่นยำและใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านไวรัสวิทยาคือ การย้อมสีพิเศษแบบ IPMA (Immunoperoxidase Monolayer Assay) ซึ่งจัดเป็นเทคนิค Immunocytochemistry ที่ผสานหลักการของปฏิกิริยาแอนติเจน–แอนติบอดีร่วมกับเอนไซม์เพอร์ออกซิเดส (Peroxidase enzyme) เพื่อแสดงตำแหน่งของไวรัสหรือโปรตีนไวรัสภายในเซลล์ที่เพาะเลี้ยงไว้ เทคนิคนี้ได้รับความนิยมเนื่องจากสามารถตรวจสอบการติดเชื้อไวรัสในระดับเซลล์ ได้อย่างแม่นยำ และไม่จำเป็นต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เหมือนวิธี IFA (Immunofluorescence Assay)
ขั้นตอนการทำ
- การเพาะเลี้ยงเซลล์ (Cell Culture)
เริ่มต้นด้วยการเพาะเลี้ยงเซลล์ใน 96 well plate จนได้ monolayer
- การลงเชื้อไวรัส (Virus Infection)
เติมตัวอย่างไวรัสลงในหลุมเพาะเลี้ยง และบ่มเพื่อให้ไวรัสสามารถเข้าสู่เซลล์ได้ (ระยะเวลาขึ้นอยู่กับชนิดของไวรัส)
- การตรึงเซลล์ (Fixation)
ใช้สารฟอร์มัลดีไฮด์ (formaldehyde) หรือน้ำยาอื่น ๆ ในการตรึงเซลล์เพื่อคงสภาพโครงสร้างของเซลล์และแอนติเจนภายใน
- การลดการจับที่ไม่จำเพาะ (Blocking)
เติมสารบล็อก เช่น BSA (Bovine Serum Albumin) เพื่อป้องกันการจับของแอนติบอดีแบบไม่จำเพาะ
- การเติม Primary แอนติบอดี (Primary Antibody)
เติมแอนติบอดีชนิดจำเพาะต่อแอนติเจนของไวรัสเป้าหมาย
- การเติม Secondary แอนติบอดี (Secondary Antibody)
เติม Secondary แอนติบอดีที่จับกับ Primary แอนติบอดี ซึ่งมีเอนไซม์ peroxidase เกาะอยู่
- การแสดงผล (Color development):
เติมตัวทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ peroxidase เช่น DAB (3,3′-diaminobenzidine) หรือ AEC เมื่อเกิดปฏิกิริยากับ peroxidase จะให้ผลเป็นสีน้ำตาลในตำแหน่งที่มีไวรัส
- การล้างและอ่านผล (Washing and Result Interpretation)
ล้างด้วย PBS เพื่อกำจัดสารส่วนเกินต่างๆ แล้วดูผลด้วยกล้องจุลทรรศน์ เพื่อหาจุดที่เกิดสีในเซลล์ที่ติดเชื้อ
ข้อดีของ IPMA
- ไม่จำเป็นต้องใช้กล้องฟลูออเรสเซนต์
- มีความไวและจำเพาะสูง
- สามารถแยกแยะตำแหน่งไวรัสภายในเซลล์ได้อย่างชัดเจน
- ใช้ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณและเชิงคุณภาพได้
แหล่งอ้างอิง
- OIE (World Organisation for Animal Health). (2019). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.
- Haines, D. M., & Chelack, B. J. (1991). Technical considerations for developing enzyme immunohistochemical staining procedures on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 3(1), 101–112.
- พงศ์พิชญ์ ภู่เจริญ. (2563). เทคนิคการย้อมสี Immunohistochemistry และ คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์.
